La caracterización integral de los microbiomas maternos, fetales y neonatales respalda la colonización prenatal del tracto gastrointestinal

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 4652 (2023) Citar este artículo

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En este estudio, nuestro objetivo fue caracterizar exhaustivamente los microbiomas de varias muestras de mujeres embarazadas y sus recién nacidos, y explorar las similitudes y asociaciones entre pares madre-recién nacido, sitios de recolección de muestras y factores obstétricos. Recolectamos muestras de flujo vaginal y líquido amniótico en mujeres embarazadas y sangre de cordón umbilical, líquido gástrico y meconio de recién nacidos. Identificamos 19.597.239 secuencias bacterianas de 641 muestras de 141 mujeres embarazadas y 178 neonatos. Al aplicar criterios de filtrado rigurosos para eliminar los contaminantes, encontramos evidencia de colonización microbiana en ambientes intrauterinos tradicionalmente considerados estériles y en el tracto gastrointestinal fetal. La distribución del microbioma estuvo fuertemente agrupada por el sitio de recolección de muestras, en lugar de los pares madre-recién nacido. La distinta composición bacteriana en el meconio, la primera materia fecal de los recién nacidos, respalda que la colonización microbiana ocurre durante el embarazo normal. El microbioma en el líquido gástrico neonatal fue similar, pero no idéntico, al del líquido amniótico materno, como se esperaba, ya que los fetos tragan líquido amniótico en el útero y su orina regresa al líquido en condiciones fisiológicas normales. Establecer una biblioteca de microbiomas a partir de varias muestras formadas solo durante el embarazo es crucial para comprender el desarrollo humano e identificar las modificaciones del microbioma en las complicaciones obstétricas.

El microbioma humano contiene potencialmente la respuesta a muchos secretos del cuerpo humano. Se ha relacionado con el mantenimiento de la homeostasis en la salud y se asocia con numerosas enfermedades1,2. La investigación reciente ha cambiado para explorar el microbioma en poblaciones menos estudiadas, como bebés o mujeres embarazadas, para comprender mejor su papel en el desarrollo humano. Es probable que el desarrollo del microbioma comience en el entorno del útero y cambie a lo largo de la vida, afectando continuamente al sistema inmunitario y al metabolismo. Se ha demostrado que el embarazo altera las poblaciones microbianas dentro del cuerpo materno y puede afectar la futura salud materna, fetal y neonatal3. El embarazo permite la inmunotolerancia temporal a un cuerpo extraño, lo que facilita la remodelación del microbioma y las posibles adaptaciones al sistema inmunitario y al metabolismo4. Algunos estudios de microbiomas en el embarazo han propuesto que los entornos fetales, incluidos la placenta y el líquido amniótico, tradicionalmente conocidos como estériles, contienen varias microbiotas características que no se identifican en las técnicas de cultivo realizadas de forma rutinaria5,6. Sin embargo, la biomasa de estas microbiotas es pequeña y se ha criticado la fiabilidad de los métodos de secuenciación y el potencial de contaminación. La asociación entre esa microbiota y condiciones obstétricas específicas aún no se ha probado y justifica una mayor investigación.

La vagina es el sitio de bacterias más comúnmente estudiado en el órgano reproductor femenino, ya que está conectado al útero a través del cuello uterino y está expuesto a la piel. Sin embargo, la investigación del microbioma en el embarazo ha avanzado lentamente debido a preocupaciones éticas y dificultades para acceder a las muestras. Aagaard et al. descubrió que el microbioma vaginal cambia durante el embarazo en función de la edad gestacional y que las especies de Lactobacillus desempeñan un papel en la prevención del crecimiento de bacterias patógenas7. Más específicamente, el embarazo conduce a una menor diversidad, una mayor proporción de Lactobacillus y una mayor estabilidad en el microbioma vaginal8,9. Algunas bacterias vaginales se han relacionado con el parto prematuro a través de la inflamación o infección intrauterina10,11,12,13,14, pero no existen pautas clínicas para evaluar o monitorear esta microbiota. Otros sitios que han sido evaluados para el microbioma en el embarazo son el materno15, la cavidad oral16, la placenta5, el líquido amniótico17,18 y el intestino neonatal19; pero los estudios anteriores eran fragmentarios y se necesita una investigación más sistemática.

En este estudio, hemos caracterizado exhaustivamente el microbioma en el flujo vaginal (VD) y el líquido amniótico (AF) de mujeres embarazadas y en la sangre del cordón umbilical (CB), el líquido gástrico (GL) y el meconio (M) de sus recién nacidos. El objetivo era determinar las relaciones entre estas muestras y diversas condiciones obstétricas.

Un total de 141 mujeres embarazadas de bajo riesgo se inscribieron secuencialmente y 178 recién nacidos nacieron de la población de estudio con 37 casos de embarazos gemelares. Todas las mujeres eran de etnia asiática (coreana) y la mediana de edad era de 34 (rango intercuartil 31-37) años (Tabla 1). La proporción de nuliparidad fue de poco más de la mitad de la población (67%), y los valores medianos de talla, peso e índice de masa corporal (IMC) fueron 162 cm, 70 kg y 27 kg/m2, respectivamente. Alrededor del 30% fueron concebidos mediante tecnología de reproducción asistida (ART), incluida la inseminación intrauterina (IUI) y la fertilización in vitro con transferencia de embriones (FIV-ET). Como se mencionó anteriormente, el embarazo gemelar fue aproximadamente una cuarta parte de la población total, y entre ellos, el 19% eran monocoriónicos. La mediana de edad gestacional al momento del parto fue de 37,7 semanas (rango intercuartil 36,9-38,6) y el parto prematuro antes de las 37 semanas de gestación fue del 26,2 % (37/141). La tasa de cesáreas fue del 55% (77/141). Siete neonatos presentaron anomalías estructurales congénitas (comunicación auriculoventricular, ausencia de cuerpo calloso en el cerebro, acondroplasia, labio hendido, polidactilia y sindactilia), que no afectaron directamente la supervivencia neonatal. Las frecuencias de otras complicaciones obstétricas o enfermedades maternas subyacentes se describen en la Tabla 1.

Identificamos 19 597 239 secuencias bacterianas y 22 412 variantes de secuencia de amplicón únicas (ASV) de 641 muestras, incluida la secreción cervicovaginal (n = 154), líquido amniótico (n = 40), líquido gástrico (n = 100), sangre del cordón umbilical (n = 125 ), meconio (n = 160) y controles negativos (n = 62). Los ASV se anotaron taxonómicamente, pero encontramos evidencia de efectos por lotes en nuestros datos de secuenciación para todos los tipos de muestras excepto VD (Fig. 1 y Fig. S1 complementaria). Los efectos por lotes probablemente se introdujeron durante la construcción de la biblioteca para la secuenciación de próxima generación (NGS) y no durante la secuenciación en sí (Figura complementaria S2). Sin embargo, esto era de esperar porque nuestras muestras se recolectaron de sitios del cuerpo con especímenes de baja biomasa, lo que hace que nuestras muestras sean propensas a la contaminación20. Por lo tanto, esperábamos encontrar muchos falsos positivos y aplicamos una serie de filtros, como se describe en la figura complementaria S3. En particular, encontramos y eliminamos 203 ASV que se determinaron estadísticamente como contaminantes porque eran muy frecuentes en los controles negativos (Figura complementaria S4) o mostraron frecuencias más altas en muestras de baja concentración (Figuras complementarias S5 y S6).

Detección de efecto por lotes en datos de secuenciación de amplicón de ARNr 16S. Se utilizó la transformación de relación logarítmica central para normalizar la tabla ASV filtrada antes de generar un mapa de calor agrupado jerárquicamente en función de los coeficientes de correlación. FA, líquido amniótico; CB, sangre de cordón umbilical; GL, líquido gástrico; M, meconio; VD, flujo cervicovaginal; NC, control negativo.

Medimos la diversidad alfa de las muestras calculando los índices de Shannon (Fig. 2A). La diversidad alfa disminuyó en el siguiente orden: GL, AF, M, CB y VD. El grupo de control negativo mostró una diversidad ligeramente mayor en comparación con la muestra de VD, lo que sugiere que los controles negativos para la secuenciación de amplicón 16S pueden tener una diversidad de microbiomas tan rica como las muestras biológicas reales. A continuación, estimamos la diversidad beta de nuestras muestras calculando las distancias UniFrac ponderadas (Fig. 2B). Las muestras estaban moderadamente bien separadas por sitio de recolección de muestras cuando se proyectaron utilizando el análisis de coordenadas principales (PCoA).

Diversidad alfa y beta del microbioma materno y neonatal coreano. (A) Diversidad alfa: la tabla ASV filtrada se enrareció antes de calcular el índice de Shannon para cada muestra. El grupo VD exhibió la menor cantidad de diversidad alfa. FA, líquido amniótico; CB, sangre de cordón umbilical; GL, líquido gástrico; M, meconio; VD, flujo cervicovaginal; NC, control negativo; (B) Diversidad beta: la tabla ASV filtrada se enrareció antes de que las muestras se proyectaran en el espacio 2D con análisis de coordenadas principales utilizando la distancia UniFrac ponderada.

Para determinar si las madres comparten microbios con sus recién nacidos, comparamos el número promedio de ASV compartidos entre parejas madre-recién nacido y 1000 parejas seleccionadas al azar de diferentes familias. Realizamos una prueba t de una cola y encontramos que los pares madre-recién nacido no tenían un mayor número de ASV compartidos en comparación con los pares seleccionados al azar (N = 0,7 frente a N = 1,8, respectivamente; p = 1,0).

Para comprender mejor las fuentes de variación observadas en la diversidad beta de nuestras muestras, llevamos a cabo el análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA) utilizando diferentes factores, incluida la información clínica. Como se muestra en la Tabla 2, cuando se incluyeron todos los tipos de muestra en el análisis, la variable "Sitio" explicó el 17,2 % de la variación (valor de p = 0,001) y la variable "MesBiblioteca" fue el 7,4 % (valor de p = 0,002). Este resultado indica que las muestras aún podrían separarse bien en función del patrón de microbioma exclusivo de su sitio corporal, a pesar de los importantes efectos por lotes presentes en nuestro conjunto de datos. Cuando el análisis se restringió a cada tipo de muestra, a excepción del grupo de muestra VD, se encontró que la variable "LibraryMonth" era significativa para todos los tipos de muestra. El poder explicativo aumentó a un rango entre 24,5 y 48,9%. Estos resultados se alinean con la hipótesis de que nuestras muestras son predominantemente especímenes de baja biomasa y propensos a la contaminación.

Además, la variable "DeliveryMethod" se devolvió como significativa para el grupo VD, las variables "PretermBirth37" y "AntibioticsUse" para el grupo M y la variable "Peso" para el grupo CB (Fig. 3). Exploramos las variables significativas en cada grupo utilizando PCoA con distancia UniFrac ponderada. Se encontraron varios ASV de Lactobacillus y un ASV de Gardnerella en el grupo VD. En el grupo M, Staphylococcus mostró una fuerte asociación con el parto prematuro. Por último, las listas de taxones bacterianos se relacionaron con los pesos de los recién nacidos en el grupo CB. La Tabla 3 muestra el análisis de la composición de los microbiomas (ANCOM) para varios datos clínicos para estudiar cualquier relevancia estadísticamente significativa con bacterias en múltiples tipos de muestras.

Resultados de diversidad beta del análisis PERMANOVA. Se muestra el análisis de coordenadas principales utilizando la distancia UniFrac ponderada para (A) las muestras de secreción cervicovaginal, (B) y (C) las muestras de meconio y (D) las muestras de sangre del cordón umbilical.

Para probar la hipótesis de que las muestras de gemelos, tanto monocoriónicos como dicoriónicos, tienen una mayor similitud en la composición del microbioma que las muestras elegidas al azar, comparamos la media de la distancia UniFrac ponderada entre las muestras de gemelos y las muestras seleccionadas al azar. Más específicamente, para cada uno de los grupos AF, CB, GL y M, realizamos una prueba de hipótesis de arranque mediante muestreo aleatorio de distancias por pares con reemplazo de todas las muestras 1000 veces para construir un intervalo de confianza del 95 % con las medias de las distancias muestreadas. Rechazamos la hipótesis nula de que no había diferencia entre las muestras gemelas y las muestras seleccionadas al azar para los cuatro tipos de muestras porque la distancia media por pares para las muestras gemelas estaba por debajo del intervalo de confianza (Fig. 4 y Fig. S7 complementaria). A continuación, dividimos a los gemelos en gemelos monocoriónicos y dicoriónicos y repetimos las pruebas de hipótesis. Descubrimos que aún podíamos rechazar la hipótesis nula para los cuatro tipos de muestras para gemelos dicoriónicos. Sin embargo, para los gemelos monocoriónicos, solo los grupos CB y M pasaron la prueba.

Mayor similitud de la composición del microbioma en muestras gemelas que en muestras elegidas al azar. Para cada tipo de muestra, se muestran las medias de las distancias UniFrac ponderadas para las muestras gemelas. Se construyó un intervalo de confianza del 95 % muestreando aleatoriamente distancias por pares con reemplazo de las muestras 1000 veces.

Se ha demostrado que varias microbiotas vaginales patogénicas y comensales tienen consecuencias importantes para la salud general y reproductiva de la mujer. Para establecer rangos de referencia de microbiota vaginal con asociaciones clínicas conocidas en mujeres embarazadas generalmente sanas, buscamos objetivos bacterianos comúnmente probados para evaluar la salud vaginal dentro de muestras de VD. Más específicamente, nos enfocamos en 31 objetivos bacterianos (15 géneros y 16 especies) que se prueban mediante el ensayo "SmartJane" de uBiome Inc., incluidos Lactobacillus, Sneathia y Gardnerella21. De los 31 taxones bacterianos de importancia clínica, 12 fueron identificados en nuestras muestras (Fig. 5).

Abundancia relativa de bacterias asociadas con la salud vaginal. Solo se muestran los objetivos bacterianos en el ensayo SmartJane de uBiome que también están presentes en las muestras de flujo vaginal.

Observamos una mayor abundancia relativa de Lactobacillus a nivel de género, pero una menor abundancia de Aerococcus, Fusobacterium, Gardnerella, Peptoniphilus, Porphyromonas y Prevotella. La mayoría de nuestras pacientes no tuvieron complicaciones graves relacionadas con el embarazo. Además, la mayoría de los partos prematuros osciló en el período prematuro tardío de 34 + 0 semanas a 36 + 6 semanas. Por lo tanto, el ensayo "SmartJane" no capturó casi ningún microbioma patógeno. Se examinó el nivel de especificación y se muestra en la Fig. 5. Encontramos Lactobacillus iners y Lactobacillus jensenii en las listas de ensayos, pero Lactobacillus crispatus no se encontraba comúnmente en el microbioma vaginal. Esto podría deberse simplemente a que la base de datos de referencia SILVA que utilizamos omitió Lactobacillus crispatus. Confirmamos que algunos de los ASV del género Lactobacillus eran de hecho Lactobacillus crispatus utilizando la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (datos no mostrados).

Dado que la contaminación es un problema crítico en la investigación del microbioma, utilizamos varios métodos actualizados para confirmar la presencia de bacterias y encontramos evidencia de colonización en el útero. La distinta composición bacteriana en el meconio, la primera materia fecal de los recién nacidos, respalda que la colonización microbiana ocurre en el ambiente intrauterino durante el embarazo normal22,23. El microbioma en el líquido gástrico neonatal fue similar al del líquido amniótico materno, como se esperaba, ya que los fetos tragan líquido amniótico en el útero y su orina regresa al líquido en condiciones fisiológicas normales. Sin embargo, el microbioma en el líquido gástrico no era exactamente el mismo que en el líquido amniótico, lo que indica la existencia de mecanismos desconocidos para la formación de flora en la cavidad bucal fetal o en el tracto gastrointestinal proximal, como el esófago, a partir del entorno intrauterino.

El estudio tuvo como objetivo determinar si las muestras de varios sitios del cuerpo de mujeres embarazadas y sus bebés tendrían microbiomas similares, o si el microbioma materno se transmitiría a su feto. Nuestros resultados sugieren que el microbioma difería principalmente en función del compartimento corporal donde se obtuvo, no del par madre-feto. Es decir, de todos los factores, incluidas varias condiciones obstétricas, el sitio de muestreo fue el factor más importante para determinar la similitud del microbioma.

La fortaleza clave de este estudio es su población de estudio, que se componía de asiáticos puros y reflejaba embarazos generales de bajo riesgo. El rango de edad materna estuvo entre 20 y 45 años, lo que se considera típico para la edad reproductiva. Hubo aproximadamente el mismo número de mujeres nulíparas, cesáreas y neonatos masculinos y femeninos. Aparte de una pequeña cantidad de casos de sufrimiento fetal, como puntajes de Apgar bajos y tinción de meconio, se excluyeron los recién nacidos con condiciones extremadamente patológicas que podrían alterar el microbioma, como parto prematuro grave y tratamiento en una unidad de cuidados intensivos neonatales (UCIN). . Como resultado, es probable que el microbioma analizado en esta población de estudio represente un embarazo típico. Es crucial establecer una biblioteca de microbiomas para mujeres embarazadas de bajo riesgo y sus recién nacidos normales como base para la comparación con condiciones patológicas, para comprender mejor la composición del microbioma durante el embarazo.

Para identificar los microbiomas asociados con las condiciones relacionadas con el embarazo, como el método de parto, realizamos un análisis estadístico de la abundancia diferencial. A pesar de los desafíos que plantea la baja biomasa microbiana y las dificultades para controlar a los sujetos del estudio, lo que puede dar lugar a resultados falsos positivos, las bacterias enumeradas en la Tabla 3 parecen alinearse con los hallazgos anteriores. Por ejemplo, Finegoldia y Bifidobacterium se han relacionado previamente con un embarazo más saludable y nuestros datos confirman esta asociación24,25. Otros taxones enumerados en la tabla también tienen vínculos con la inflamación y las complicaciones del embarazo, como la diabetes mellitus gestacional, la preeclampsia y el parto prematuro. La presencia de Campylobacter y Lachnospiraceae en el flujo vaginal, por ejemplo, está en línea con investigaciones anteriores que muestran que estas infecciones bacterianas pueden provocar inflamación y parto prematuro26,27.

Mediante referencias cruzadas con bases de datos clínicas, nuestro análisis reveló varias asociaciones significativas. Primero, la abundante presencia de Lactobacillus y Gardnerella en el flujo vaginal es un indicador bien conocido del microbioma del embarazo. Lactobacillus juega un papel protector en el microbioma materno durante el embarazo, mientras que Gardnerella se considera un patógeno y está fuertemente asociado con el parto prematuro o las complicaciones del embarazo11,13,26. Llama la atención la presencia de Faecalibacterium en la sangre del cordón umbilical, cuya depleción se ha demostrado en la diabetes mellitus gestacional28, aunque el número de casos en nuestra población de estudio fue relativamente pequeño. Además, se encontró que Staphylococcus estaba fuertemente asociado con el parto prematuro en el meconio. Este resultado coincide con hallazgos previos que sugieren que las infecciones por Staphylococcus pueden provocar partos prematuros29,30.

En cuanto al efecto de los antibióticos, analizamos la relación entre el uso de antibióticos y las muestras de meconio, pero los resultados mostraron una asociación limitada debido al pequeño tamaño de la muestra. Como Tormo-Badia et al. informado, los antibióticos pueden alterar el microbioma intestinal de la descendencia en ratones preñados31. Dado que la existencia de un "microbioma saludable" durante el embarazo se considera crucial para mantener un embarazo normal, es fácil imaginar las posibles consecuencias negativas de la administración de antibióticos durante el embarazo. Dado que los antibióticos solo se administran a mujeres embarazadas que presentan signos de infección o inflamación, enfermedades específicas o ruptura prematura de membranas pretérmino con riesgo de infección ascendente al feto, es prácticamente un desafío determinar el efecto de los antibióticos en la modificación de la microbioma relacionado con el nacimiento.

Las muestras de meconio mostraron la presencia de taxones de microbiomas como Lactobacillus, Staphylococcus y Ureaplasma, que se conocen colectivamente como la flora vaginal11,32. Intentamos evaluar la relación entre el modo de entrega y el microbioma en el meconio, pero no encontramos diferencias estadísticamente significativas en la composición o diversidad. Según un estudio de Domínguez-Bello et al., existen diferencias en las comunidades bacterianas del intestino de los lactantes según el modo de parto33. Los recién nacidos por vía vaginal tienen un microbioma que se asemeja a la microbiota vaginal de su madre, dominada por Lactobacillus. Por el contrario, los bebés nacidos por cesárea tienen un microbioma dominado por Staphylococcus, Corynebacterium y Propionibacterium, que se encuentran comúnmente en la superficie de la piel de sus madres.

Aproximadamente una cuarta parte de los embarazos en nuestro estudio fueron embarazos gemelares (37/141). Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que evalúa los microbiomas de los recién nacidos gemelos. En general, nuestras muestras de gemelos (AF, CB, GL y M) mostraron una composición más similar en comparación con las muestras seleccionadas al azar, incluso para gemelos dicoriónicos que tienen compartimentos intrauterinos separados. La única excepción fueron las muestras CB y M de gemelos monocoriónicos, donde las muestras seleccionadas al azar mostraron una mayor similitud, lo que probablemente se deba al pequeño tamaño de la muestra de gemelos monocoriónicos.

La exploración de las características microbiológicas relacionadas con el embarazo ha sido una tarea desafiante y controvertida durante muchos años. La invasión microbiana de la cavidad gestacional, como el líquido amniótico o la placenta, puede provocar complicaciones obstétricas graves, como parto prematuro y morbilidad neonatal grave que puede persistir durante toda la vida. A pesar de la importancia de la investigación sobre el microbioma en el embarazo, el progreso ha sido limitado debido a cuestiones éticas y de accesibilidad. Recolectamos varias muestras de mujeres embarazadas y sus recién nacidos mediante un protocolo estandarizado y establecimos una base de datos de microbiomas, que puede servir como biblioteca de referencia para estudiar muestras con otras afecciones patológicas o relacionadas con el embarazo.

Se realizó un estudio prospectivo en nacidos vivos nacidos entre marzo de 2020 y enero de 2021. Se recolectaron muestras de mujeres que habían dado a luz en el Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl y sus recién nacidos. Se excluyeron del estudio las mujeres con signos vitales inestables o aquellas que requerían manejo urgente como transfusión y los recién nacidos ingresados en la UCIN o que tenían signos vitales inestables después del parto. Las muestras para el análisis del microbioma incluyeron VD, AF, CB, GL neonatal y M maternos. Como una mujer embarazada estaba hospitalizada con expectativa de parto, la muestra de VD se obtuvo utilizando un hisopo de poliéster insertado en el fórnix posterior de la vagina, asistido por estéril examen con espéculo Para aquellas que se habían sometido a cesárea para el parto o amniocentesis por indicaciones específicas (es decir, para la detección de inflamación/infección intraamniótica), se obtuvieron aproximadamente 10 cc de FA a través de una jeringa para el estudio. Durante el parto, tanto por cesárea como por parto vaginal, se tomaron aproximadamente 20 cc de CB a través de una jeringa de la vena del cordón umbilical inmediatamente después del pinzamiento. La aguja de la jeringa se insertó directamente en el cordón umbilical en el lugar del parto rodeada de paños estériles para minimizar la contaminación del campo quirúrgico. Dado que extraer líquido amniótico u otro líquido de la boca y el estómago del recién nacido después del nacimiento es parte del tratamiento inicial para ayudar a las vías respiratorias y estimular la respiración espontánea, la mayoría de los recién nacidos recibieron procedimientos de succión y el líquido se recogió en el frasco de succión (aproximadamente 15 ml) se llevó a un tubo cónico para el análisis de GL. La muestra M, las heces muy tempranas del recién nacido, se obtuvo cuidadosamente dentro de las 24 horas posteriores al nacimiento utilizando un hisopo de poliéster insertado en el ano mientras el recién nacido se estabilizaba después del manejo inicial. Tratamos de recolectar las cinco muestras diferentes de cada mujer y neonato(s), sin embargo, una pequeña parte de las muestras de pares de madre-recién nacido no se obtuvieron o se perdieron por circunstancias clínicas. El resultado primario fue la distribución y composición del microbioma de las muestras anteriores de mujeres embarazadas y sus recién nacidos. Para determinar la asociación entre el microbioma de diferentes compartimentos y los factores obstétricos, se recopilaron y revisaron minuciosamente los registros médicos. Los datos incluyeron la edad materna, la edad gestacional al momento del parto, el tipo de parto (parto vaginal o cesárea), el uso de TRA, otras complicaciones obstétricas y resultados neonatales como el sexo y el peso al nacer.

Este estudio se realizó con el consentimiento informado de los participantes apropiados de conformidad con la Declaración de Helsinki. El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl (B-1606/350-003).

El ácido desoxirribonucleico (ADN) microbiano se extrajo de las muestras VD, GL, AF y CB con el kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep (Zymo Research, Irvine, CA) y la muestra M con el kit DNeasy PowerSoil Pro (Qiagen, Germantown, MD) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las muestras se lisaron enzimática y mecánicamente mediante batido de perlas, seguido de lavado y filtración en la columna provista. Las concentraciones de ADN extraído se midieron con un kit de ensayo Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Las cantidades totales de ADN extraído variaron según los tipos de muestra, como 1–10 ug para VD, 3 μg para CB, 30–200 ng para M y 50 ng para GL y AF. Por cada caja del kit de extracción de ADN utilizada, no se utilizó ningún material como control negativo. Los blancos se procesaron en todo el protocolo y se analizaron.

El gen del ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) 16S se amplificó usando el protocolo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de dos pasos en la preparación de la biblioteca de secuenciación metagenómica 16S (Illumina, San Diego, CA). En el primer paso de PCR, la región hipervariable V3–V4 del gen 16S rRNA se amplificó usando 10 ng de cada muestra, 10 µM de cebadores 341F/785R y ADN polimerasa de fusión Herculase II (Agilent, Santa Clara, CA). En la siguiente secuencia de cebadores, la base 'N' se selecciona de cualquier base aleatoria, la base 'W' es A o T, la base 'H' es A, C o T, y la base 'V' es A, C o G.

341F: 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′

785R: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′

El ciclado de PCR se realizó con un ciclo inicial a 95 °C por 3 min, seguido de 25 ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 30 s y un ciclo final de extensión a 72 ° C durante 5 min. Los amplicones se limpiaron con perlas AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.). En la segunda PCR, se agregaron cebadores índice del Nextera DNA CD Index Kit (Illumina, San Diego, CA) a los extremos de los amplicones generados en la primera PCR. El ciclado de PCR se realizó con un ciclo inicial a 95 °C por 3 min, seguido de diez ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 30 s y un ciclo final de extensión a 72 ° C durante 5 min. Cada muestra se limpió con perlas AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.) y se eluyó en UltraPure DNase/RNase-Free Water (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). El ADN amplificado se verificó utilizando un sistema Bioanalyzer 2100 utilizando un kit Agilent DNA 1000 (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). Para cada producción de biblioteca, no se utilizó ninguna plantilla como control negativo.

Según el tamaño y la concentración del ADN, los amplicones se agruparon en cantidades equimolares y se añadieron PhiX al 30 % (Illumina, San Diego, CA). A continuación, se secuenciaron en la plataforma Illumina MiSeq utilizando el kit de reactivos MiSeq V2 de 250 ciclos de dos extremos (Illumina, San Diego, CA) y un kit de reactivos MiSeq V3 de 300 ciclos (Illumina, San Diego, CA). Se secuenciaron los controles negativos de la biblioteca y la extracción de ADN.

Dividimos las muestras en nueve lotes (Ejecuciones 1–9) y secuenciamos la región V3-V4 del gen 16S rRNA usando máquinas Illumina MiSeq con una profundidad objetivo de 100 000 por muestra (Figura complementaria S8). La secuenciación se realizó con lecturas de extremos emparejados de 250 pb para todas las ejecuciones de secuenciación excepto la última (Ejecución 9), donde la secuenciación se realizó con lecturas de extremos emparejados de 300 pb por razones prácticas. Los puntajes de calidad de lectura para cada ejecución de secuenciación se muestran en la figura complementaria S9. El programa bcf2fastq de Illumina se utilizó para desmultiplexar datos de secuenciación sin procesar (archivos BCL) y generar archivos FASTQ directos e inversos para cada muestra. Cabe destacar que algunas muestras se secuenciaron más de una vez para evaluar el impacto de los efectos por lotes. Estos incluían "duplicados de secuenciación" en los que la biblioteca NGS idéntica de una muestra se secuenciaba en ejecuciones separadas y "duplicados de biblioteca" en los que se preparaban múltiples bibliotecas NGS a partir de la muestra idéntica en fechas diferentes y luego se secuenciaban por separado.

A menos que se indique lo contrario, todos los análisis se llevaron a cabo utilizando la plataforma QIIME 2, una poderosa plataforma desarrollada por la comunidad para la bioinformática del microbioma34. Para cada ejecución de secuenciación, los archivos FASTQ se importaron a QIIME 2 y al complemento DADA235 para identificar los ASV recortando las partes de baja calidad de las lecturas de secuencia, eliminando el ruido de las lecturas recortadas y luego fusionando las lecturas directa e inversa (Figura complementaria S8). Los ASV observados de las ejecuciones de secuenciación individuales se combinaron luego en una tabla de ASV. Para detectar y eliminar posibles contaminantes, ejecutamos el programa de descontaminación en nuestras muestras, que buscaba ASV por lote de secuenciación que aparecían con frecuencias más altas en muestras de baja concentración y se encontraban repetidamente en el control negativo36. La clasificación taxonómica se realizó utilizando un clasificador naive Bayes utilizando la base de datos SILVA37. Para visualizar los resultados de QIIME 2, desarrollamos el programa Dokdo (https://github.com/sbslee/dokdo), un paquete Python de código abierto y con licencia MIT para el análisis de secuenciación de microbiomas usando QIIME 2. Dokdo usa internamente la aplicación interfaz de programación de QIIME 2 y, por lo tanto, no requiere ninguna otra dependencia. Dokdo se puede utilizar para realizar una variedad de análisis secundarios o crear cifras con calidad de publicación a partir de archivos/objetos QIIME 2 (por ejemplo, un gráfico de barras taxonómicas o un gráfico de rarefacción alfa).

Utilizamos el comando QIIME 2 "qiime diversity core-metrics-phylogenetic" para calcular las métricas de diversidad alfa y beta de nuestras muestras. Al ejecutar el comando, para normalizar la diferencia en la profundidad de lectura entre las muestras, usamos la opción "-p-sampling- depth" para enrarecer nuestras muestras a 5000 lecturas de secuencia y tener la misma profundidad de cobertura. También nos aseguramos de que todas las muestras se secuenciaran con una profundidad de cobertura suficiente para el análisis de diversidad mediante la creación de curvas de rarefacción (Figura complementaria S10). Además, utilizamos la opción "-i-phylogeny" para proporcionar un árbol filogenético enraizado de ASV observados, que se requiere para realizar PCoA en función de la distancia UniFrac ponderada38.

Para evaluar la abundancia diferencial del microbioma en el contexto de la información clínica, como el parto prematuro, utilizamos el comando QIIME 2 "composición qiime ancom" para realizar ANCOM, que compara la relación logarítmica centrada (CLR) de abundancia relativa entre dos o más grupos de muestras39. Para determinar si los grupos de muestras son significativamente diferentes entre sí en diversidad beta, llevamos a cabo PERMANOVA utilizando el comando QIIME 2 "qiime diversity adonis" que ajusta los supuestos del modelo lineal a una matriz de distancia (por ejemplo, UniFrac ponderada) con las variables elegidas. Realizamos pruebas de hipótesis de arranque mediante la construcción de un intervalo de confianza del 95 % con el método "scipy.stats.t.interval" en el paquete scipy para comparar las similitudes en la composición del microbioma entre gemelos y muestras elegidas al azar40.

Los datos de secuenciación generados a partir de este estudio se han depositado en las bases de datos de INSDC a través del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el número de acceso PRJEB52455. La URL de ENA es https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB52455. Los datos generados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable por escrito.

Líquido amniótico

Análisis de la composición de los microbiomas

tecnología de reproducción asistida

Variantes de secuencia de amplicón

Índice de masa corporal

Sangre del cordón umbilical

Relación logarítmica centrada

Ácido desoxirribonucleico

líquido gástrico

Inseminación intrauterina

Fertilización in vitro y transferencia de embriones

meconio

Centro Nacional de Información Biotecnológica

Secuenciación de última generación

Unidad de cuidado intensivo neonatal

Análisis de coordenadas principales

Reacción en cadena de la polimerasa

Análisis de varianza multivariante permutacional

Ácido ribonucleico ribosomal

Secreción cervicovaginal

Mesa, MD y col. El microbioma en evolución desde el embarazo hasta la primera infancia: una revisión exhaustiva. Nutrientes https://doi.org/10.3390/nu12010133 (2020).

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Este estudio fue apoyado por el Fondo de Investigación del Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl (14-2017-026) y el proyecto de clase mundial 300 del Ministerio de PyMEs y Start-ups.

Estos autores contribuyeron por igual: Jee Yoon Park y Huiyoung Yun.

Departamento de Obstetricia y Ginecología, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Seúl, República de Corea

Parque Jee Yoon y Parque Joong Shin

Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl, Gyeonggi-do, República de Corea

Jee Yoon Park y Hyeon Ji Kim

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Seúl, Seúl, República de Corea

Young Hwa Jung y Chang Won Choi

Departamento de Pediatría, Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl, Gyeonggi-do, República de Corea

Young Hwa Jung y Chang Won Choi

Centro de Medicina de Precisión, Hospital Bundang de la Universidad Nacional de Seúl, Gyeonggi-do, República de Corea

Huiyoung Yun, Seung-been Lee, Jong-Yeon Shin y Jeong-Sun Seo

Macrogen Inc, Seúl, República de Corea

Huiyoung Yun, Seung-been Lee, Jong-Yeon Shin y Jeong-Sun Seo

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Correspondencia a Joong Shin Park o Jeong-Sun Seo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Park, JY, Yun, H., Lee, Sb. et al. La caracterización integral de los microbiomas maternos, fetales y neonatales respalda la colonización prenatal del tracto gastrointestinal. Informe científico 13, 4652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31049-1

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Recibido: 22 Abril 2022

Aceptado: 06 marzo 2023

Publicado: 21 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31049-1

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